产品货号:
YTB4007
中文名称:
离心柱式病毒RNA提取试剂盒
英文名称:
RNasy Viral RNA Isolation Kit with Spin Column
产品规格:
10T|50T|200T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本制品是一种基于离心柱法从含病毒的血浆、血清、体液、拭子及细胞及其培养上清、组织等样品中安全、快速、便捷、稳定、高效、高质量地抽提长度大于200个核苷酸(nucleotide,nt)的病毒RNA的试剂盒。抽提获得的大于200个核苷酸的病毒RNA样品(可能同时含有样品中的其它RNA)可以用于各种常规用途。
本试剂盒抽提得到的病毒RNA可用于qRT-PCR、反转录、RT-PCR、qPCR、Northern、点杂交(Dot Blot)、纯化mRNA、体外翻译、RNase protection assay、cDNA克隆等下游实验;也可用于基因表达芯片分析(microarray)、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。
本试剂盒适用于含病毒的血浆、血清、体液、拭子及细胞及其培养上清、组织等样品中病毒RNA的抽提,为提高病毒RNA的提取量,建议自备carrier RNA。Carrier RNA一方面可以提高微量病毒RNA在纯化过程中与纯化柱的结合效率和洗脱效率;另一方面可以降低被可能存在的痕量残留RNase降解的风险。Carrier RNA在病毒含量较少的情况下效果更为明显。Carrier RNA推荐购买百奥莱博的Carrier RNA (病毒RNA等抽提用,货号:YTB4091)。
- 本试剂盒使用安全:
本试剂盒通过特殊的柱纯化介质进行病毒RNA分离纯化,能有效避免传统的Trizol法抽提时使用的酚、氯仿等有毒有害有机试剂。 - 本试剂盒使用快速、便捷:
本试剂盒采用柱纯化,无需繁琐的病毒RNA沉淀步骤,抽提操作过程仅15~20分钟。相比于传统的Trizol抽提法,本试剂盒的操作流程显著简化,缩短了抽提时间,降低了病毒RNA被降解的风险。和国外同类柱纯化产品相比,所需操作步骤和操作时间基本一致。
组分 | 10T | 50T | 200T |
裂解液 | 8mL | 32mL | 125mL |
结合液 | 8mL | 32mL | 125mL |
洗涤液I | 8mL | 32mL | 125mL |
洗涤液II | 15mL | 63mL | 125mL×2 |
洗脱液 | 1.2mL | 5mL | 15mL |
RNA纯化柱及废液收集管 | 12套 | 50套 | 200套 |
RNA洗脱管 | 12个 | 50个 | 200个 |
保存:室温,有效期1年。
- 如果样品中含有细胞或组织,不影响病毒RNA的抽提,但须注意抽提获得的病毒RNA中包含细胞或组织的RNA。
- 为提高病毒RNA的提取量,推荐使用百奥莱博的Carrier RNA (病毒RNA等抽提用,货号:YTB4091)或自备carrier RNA。
- 本试剂盒提供的所有试剂和耗材都是RNase-free,操作时应小心,避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果可能有RNase污染,可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜,然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话,以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
- 对于操作环境中RNA酶的去除,推荐使用核酸酶喷雾清除剂(货号:YT400)以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
- 使用冻存的样品抽提RNA的效果通常比新鲜的样品差一些。因为在样品冻融过程中一些RNase会被释放出来并消化样品中的RNA,建议尽量避免冻融。对于病毒样品,推荐使用RNAstable病毒RNA保存液(货号:YTB4038)进行保存以保证样品RNA的完整性。
- 本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
- 废液收集管在一次抽提中需多次使用,切勿中途丢弃。
- 结合液、洗涤液中含有乙醇,使用后须旋紧瓶盖以防挥发,并须按照易燃试剂的相关规范进行存放和使用。
本试剂盒抽提病毒RNA的基本流程如图1所示。样品在裂解液中迅速裂解,释放出总RNA,然后让RNA特异性地结合到纯化柱上,而蛋白质等其它组分通过高速离心被有效去除,再通过3次洗涤充分去除非特异性结合的蛋白、盐等杂质,最后用洗脱液将高纯度的RNA洗脱下来。
图1.离心柱式病毒RNA抽提流程示意图
- 样品的准备。
- 液体样品的准备。
含病毒的血浆、血清、无细胞体液、拭子、细胞培养上清等样品,按照常规方法取样。每100μL液体样品加入300μL裂解液。轻轻颠倒混匀3~5次。
选做:为提高病毒RNA的提取量,建议在不含或含很少细胞或者组织的样品中加入carrier RNA。推荐使用百奥莱博的Carrier RNA (病毒RNA等抽提用,货号:YTB4091),或使用下面方法提取:取任意新鲜的细胞或组织,用抽提试剂盒(推荐RNasy动物RNA抽提试剂盒(离心柱式,货号:YTB4004)或Trizol法提取RNA (货号:YT526、YT527),作为carrier RNA。每个病毒样品需要2~5μg carrier RNA,直接添加至裂解液中即可。 - 细胞样品的准备。
收集50~100万左右带有病毒的细胞。对于悬浮细胞,1000~2000×g离心1分钟后弃上清,加入300μL裂解液,轻轻吹打8~10次至固悬物溶解、溶液澄清;对于贴壁细胞,吸净培养液后加入300μL裂解液,轻轻吹打5~10次至固悬物溶解、溶液澄清,转移至一洁净离心管内。 - 组织样品的准备。
取15~20mg带有病毒的动物组织,置于液氮中研磨成粉末,立即加入600μL裂解液。也可将组织置于1.5mL离心管中,迅速加入600μL冰浴预冷的裂解液,用微型电动匀浆器匀浆,或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。研磨或匀浆后,轻轻吹打匀浆液8~10次,室温放置3~5分钟。然后约14000×g离心2分钟,将上清液移至新的离心管中。对于比较容易裂解且匀浆很充分的组织(如肝组织、脑组织等)可以不用高速离心而直接进入步骤2。
注意:细胞的数量一般不超过500万,不超过100万细胞宜使用300μL裂解液,多于100万细胞宜使用600μL裂解液。动物组织的用量一般不超过30mg,用量过多可能会因裂解不充分导致得率下降。组织样品在裂解和离心后,离心管下部可能会有一些胶状物质,宜作为上清转移至下一步操作。如果弃除胶状物,会导致得率下降约30~50%。后续加入结合液后胶状物会消失。离心是为了去除未匀浆充分的明显块状物。如果裂解后仍有粘稠物,需增加吹打次数至溶液完全澄清。对于富含RNase的样品,裂解液中宜添加DTT至终浓度为40mM或添加β-巯基乙醇至终浓度为1%。
- 液体样品的准备。
- 加入等体积(指病毒样品和裂解液的总体积)结合液至裂解液中,轻轻颠倒混匀3~5次。此时可能会有沉淀物产生,属于正常现象。
- 将混合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内,12000×g离心30秒,倒弃收集管内液体。
注意:当裂解液的体积大于300μL时,在加入等体积结合液后,总体积会超过纯化柱的容量,这时应分成2次过柱,即将一半的混合物过柱后,再将剩余的混合物重复步骤3一次。对于一些特殊的样品,如出现溶液未完全通过时,可延长离心时间至1~2分钟,或者加大离心力至16000×g。对于一些能快速启动达到12000×g的离心机,离心30秒已经足够,对于一些启动速度缓慢的离心机本步骤及后续步骤中的30秒离心宜调整为60秒。 - 加入600μL洗涤液I,12000×g离心30秒,倒弃收集管内液体。
- 加入600μL洗涤液II,12000×g离心30秒,倒弃收集管内液体。
- 重复步骤5一次。
- 最高速(约14000~16000×g)离心2分钟,去除残留的液体。
- 将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中,加入30~50μL洗脱液,室温放置2~3分钟,最高速离心30秒,所得溶液即为纯化的病毒RNA样品。样品病毒RNA提取量可能会较少,用紫外分光光度计较难测出,建议用qRT-PCR法检测,推荐使用百奥莱博的ByFast Probe One-Step qPCR Mix(货号:YTB3005)或者ByFast SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit(货号:YTB4068)。不同数量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的病毒样品常规保存液(货号:YTB4043)中,用本试剂盒提取病毒后使用新型冠状病毒(2019-nCoV)双荧光qRT-PCR试剂盒进行检测,此处的病毒量为每个PCR反应体系中病毒的IU数。
Amount of virus (IU/Reaction) 400 40 4 Ct Value Replicate 1 24.58 27.93 32.19 Replicate 2 25.07 28.27 31.58 Replicate 3 25.21 28.05 31.73 Average 24.95 28.09 31.84
注意:洗脱液需要加到纯化柱柱面中央,使其被完全吸收。如需获得更高浓度的样品,可把洗脱液的体积减小至20μL,但洗脱下来的RNA量会相对减少。室温较低时,洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外,洗脱后的溶液再次加回到原纯化柱再离心洗脱一次,可提高得率约10~30%;或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次,会获得约为第一次洗脱量15~40%的RNA。
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